La sintesi dell'acido nucleico viene effettuata utilizzando il metodo del trigliceride dell'ammide sialica in fase solida, per cui l'estremità 3' del DNA viene immobilizzata su un substrato in fase solida e i nucleotidi vengono aggiunti nella direzione da 3' a 5' fino alla sintesi del frammento di DNA desiderato .Ciò differisce dalla sintesi del DNA mediante l'applicazione della DNA polimerasi.
L'estremità 3' della prima base viene immobilizzata su CPG durante la sintesi, il 5'-OH della base successiva è protetto con di-p-tolil tritil DMT, il gruppo amminico della base è protetto con acido benzoico e l'estremità 3' -OH viene quindi attivato con un composto amminofosfato.1 base di 5 5′-OH di 1 base e 3′-OH della base successiva formano un trigliceride fosfito, che viene poi ossidato con iodio in un trigliceride fosfato, il protettivo sulla seconda base 5′-OH viene rimosso mediante aggiungendo acido dicloroacetico DM cicli attraverso l'aggiunta della base successiva, e dopo la sintesi il protettivo sul 5′-OH viene rimosso con un acido debole Il frammento viene disconnesso dalla resina solida con idrossido di ammonio concentrato, il protettivo viene rimosso dalla base con idrossido di ammonio concentrato sotto riscaldamento, l'idrossido di ammonio viene rimosso, il frammento viene essiccato sotto vuoto e l'acido nucleico viene purificato mediante cromatografia liquida o PAGE.
Fasi della sintesi dell'oligo
Sblocco
ILIl gruppo protettivo DMT a 5 estremità viene rimosso aggiungendo la soluzione TCA.
Attivazione
Miscelazione dell'attivatore con il monomero oligonucleotidico per formare l'intermedio monomero oligonucleotidico attivo.
Accoppiamento
Il gruppo ossidrile a 5 terminali reagisce con l'oligonucleotide intermedio attivo in una reazione di condensazione anti-generativa per formare un legame trigliceride fosfito instabile.
Tappatura
L'aggiunta di un agente di incappucciamento esegue una reazione di incappucciamento di acetilazione con gruppi idrossilici in eccesso che non sono coinvolti nella reazione di condensazione.
Ossidazione
L'aggiunta di una soluzione di iodio contenente acqua reagisce con i legami fosfito instabili mediante ossidazione per formare legami stabili di trigliceridi di acido fosforico.
Scissione del cianoetile
L'acido nucleico prodotto dopo la sintesi, con l'aggiunta di una soluzione DEA per rimuovere il gruppo cianoetile dal legame trigliceride fosfato.
Scissione e deprotezione
I frammenti di acido nucleico vengono scissi dal supporto in fase solida aggiungendo una soluzione concentrata di idrossido di ammonio e quindi riscaldati per rimuovere i gruppi protettivi dai legami idrogeno delle basi.
Orario di pubblicazione: 21 novembre 2022